DNA Profillemesi (DNA Tiplemesi)

DNA Profilleme Yöntemleri

Altı kişide VNTR alel uzunluğu varyasyonları

İşlem, kişinin DNA'sından bir örnek almakla başlar (buna genelde "referans örnek" denir). Referans örneği elde etmenin en arzu edilen yöntemi yanak içi sürüntüdür, çünkü bu kontaminasyon olasılığını düşürür. Bu mümkün olmadığı zaman, (örneğin mahkeme emri gerekmektedir ve yoktur) başka yöntemlerin kullanılması gerekebilir (örneğin, diş fırçası, jilet, vb.) veya depolanmış örnekler (dondurulmuş sperm veya biyopsi dokusu). Biyolojik akrabalardan elde edilen örnekler veya daha önceden profillemesi yapılmış insan kalıntıları da kişinin profili hakkında bilgi verebilir
Referans örnek aşağıda ayrıntıları verilen tekniklerden biri ile analiz edilerek kişinin DNA profili elde edilir. DNA profili sonra başka bir örneğinki ile karşılaştırılarak genetik bir eşleşme olup olmadığı belirlenir.

1. RFLP analizi
DNA profillemesinde kullanılan ilk yöntemler restriksiyon enzimi sindirimi ve ardından Southern blot analizinden oluşmuştur. Restriksiyon enziminin kesim yerinde polimorfizm olabilse de, daha yaygın olarak enzim ve DNA probları VNTR konumlarının lokus analizinde kullanılmıştır. Fakat, Southern blot yöntemi emek-yoğundur ve çok miktarda yıkıma uğramamış örnek DNA'ya gerek gösterir. Ayrıca, Karl Brown'un özgün tekniği pek çok miniuydu konumuna aynı anda bakmaktaydı, böylece daha çok çeşitlilik gözlemlenebilmekte ama her bir alelin ayırt edilmesi daha zorlaşmaktaydı (bu yüzden de babalık testinde kullanılamıyordu). Bu ilk yöntemlerin yerini PCR'ye dayalı yöntemler almıştır.

2. PCR analizi
Polimeraz zincir tepkimesi (İng. polymerase chain reaction veya PCR) yönteminin icadı ile DNA profillemesi hem ayırdedicilik hem de çok düşük miktarlı (veya bozunmuş) başlangıç malzemesinden bilgi edebilme bakımından büyük aşamalar katetti. PCR, DNA'nın belli bir bölgesinin çok büyük miktarda çoğaltmak için kullanılır, bunun için oligonükleotit primerler ve ısıya dayanıklı DNA polimeraz kullanılır. HLA-DQ alfa ters dot blot şeritler gibi ilk testler, kolay olmalarından ve hızlı sonuç vermelerinden dolayı çok popüler oldular. Fakat RFLP kadar ayırdedici değildiler. Ayrıca karışık örneklerden (örneğin bir cinsel taciz kurbanından alınma vajinal sürüntüden) DNA profili elde etmek zordu, Bu sorunlara rağmen, PCR yöntemi VNTR lokuslarını analiz etmeye kolaylıkla uygulanabilir. ABD Federal Tahkikat Bürosu (FBI) DNA tiplemesi için 13 VNTR analizini standartlaştırmıştır ve adlî vakalarda kimlik tespiti için CODIS veritabanını düzenlemiştir. Başka ülkelerde de benzer testler ve veritabanları kurulmuştur. Ayrıca, SNP analizi için ticarî kitler de mevcuttur. Bu kitler ile bilinen varyasyonları olan genomik bölgeleri PCR kullanılarak çoğaltılır, bunlar özel kartlara tutturulmuş DNA probları ile hibridize edilir, bunun sonucunda belli bir dizinin varyasyonuna karşılık gelen renkli bir benek edilir.

3. STR analizi
Günümüzde kullanılan DNA profillemesi PCR ve kısa bitişik tekrarlara (İng. short tandem repeats veya STR) dayalıdır. Bu yöntemde kısa tekrar eden DNA dizilerine sahip, son derece polimorfik bölgelere bakılır (en yaygın olarak tekrar eden 4 bazlı bölgelere bakılır ama 3, 5 ve başka sayıda baz tekrarları da kullanılır). Akraba olmayan kişilerde bu tekrar eden birimlerden farklı sayılarda olduğu için, bu DNA bölgeleri birbirlerine akraba olmayan kişilerin ayırdedilmesinde kullanılabilir. Bu STR lokusları (konumları) dizi-spesifik primerler kullanılarak PCR ile çoğaltılır. Elde edilen DNA parçaları sonra elektroforez ile ayrıştırılır ve tespit edilir. Bu amaç için kullanılan iki elektroforez yöntemi vardır, kapiler elektroforez ve jel elektroforezi. Her bir STR bölgesinde görülen polimorfizmlerin her biri oldukça yaygındır, tipik olarak her biri toplumun %5-20'si tarafından paylaşılır. Birden çok lokusa bakılınca bu polimorfizmlerin kombinasyonunun tek bir kişiye özgü olması, bu yöntemi kimlik tespitinde ayırdedici bir araç kılar. Ne kadar çok STR bölgesine bakılırsa test de o derece daha ayırdedici olur.
Farklı ülkelerde farklı STR-temelli DNA profilleme sistemleri kullanılır. Kuzey Amerika'da CODIS'teki 13 lokusu çoğaltan sistemler en yaygındır, Birleşik Krallık'ta ise o ülkenin Millî DNA veritabanı ile uyumlu olan SGM+ sitemi kullanılır. Bu DNA profilleme sistemlerinde aynı zamanda pek çok STR bölgesinin test edildiği çoklu tepkimeler kullanılır.
Kapiler elektroforezde, içi bir polimerlerle dolu ince cam tübün (kapiler veya kılcal tübün) içine DNA parçaları bir elektrik alanının etkisiyle (elektrokinetik olarak) enjekte edilir. Sonra, gene bir elektrik alanının etkisiyle DNA parçaları bu tüp içinde, küçük parçalar büyük olanlardan daha hızlı olmak üzere, ilerler. PCR sırasında kullanılan primerlere bağlanmış flüoresan etiketler sayesinde kapiler tüpte ayrıştırılan DNA parçaların hangi tepkimenin ürünü olduğu anlaşılabilir. Bu sayede birden çok DNA parçasının PCR ile çoğaltılması ve beraber elektroforez edilmesi mümkün olur, buna multipleksleme denir. Farklı büyüklükte ve işaretlenmiş DNA standartlarının her bir örneğe dâhil edilmesi ile parçaların büyüklükleri belirlenir, bu büyüklük bilinen tüm alelleri listeleyen bir tablo ile karşılaştırılarak polimorfik tekrar sayısı bulunur. Bu yöntem pahalı olmakla beraber yüksek kapasiteli makinalar kullanılarak örnek başına daha düşük bir masrafa ulaşmak ve çoğu adli laboratuvardaki iş yükünü azaltmak mümkündür.
Jel elektroforezi kapiler elektroforeze (KE) benzer bir prensibe göre çalışır ama DNA parçalarını ayrıştırmak için kapiler tüp yerine iki cam tabaka arasında oluşturulmuş bir poliakrilamit jel kullanılır. KE de olduğu gibi bir elektrik alan uygulanır ama tüm örneklerin tek bir detektör tarafından algılanması yerine küçük parçalar jelin alt ucuna varana kadar elektroforez yapılır, sonra tüm jelin görüntüsü taranarak bir bilgisayara yüklenir. Bu işlemle elde edilen görüntüde farklı tekrarların büyüklükleri ve bir alel "merdiveni" (tüm aleller merdiven basmakları gibi alt alta dizilidir) görünür. Bu yöntemde büyüklük standartları kullanılmaz çünkü örneklerin yanı sıra ayrıştırılan alel merdiveni aynı işe yarar. Görselleştirme için tarama yapmadan flüoresan işaretleme veya gümüş boyama kullanılır. Bu yöntem daha ucuz olmak ve işlem hacmi nispeten yüksek olmakla beraber STR analizi için gümüş boyama giderek daha az kullanılmaktadır. Çoğu laboratuvar, KE makinelerinin fiyatları düştükçe jel kullanmaktan KE'ye geçmektedir.
STR analizinin en büyük avantajı onun ayırdetmetmedeki istatiksek gücüdür. ABD'de, CODIS'e göre ayırdetme için kullanılan 13 esas lokus (genetik konum) vardır. Bu lokuslar birbirlerinden bağımsız olarak bir araya geldikleri için (bir lokustaki bir tekrar dizisinden belli sayıda olması başka bir lokustaki tekrar sayısına etki etmez), olasılıkların çarpımı kuralı uygulanabilir. Bu demektir ki, birbirinden bağımsız üç lokus için "ABC" DNA tipine sahip olma olasılığı, A olma olasılığı çarpı B olma olasılığı çarpı C olma olasılığıdır. Bu prensibe dayanarak bir kintilyonda bir (virgülden sonra 17 sıfır ve 1 ile gösterilen sayı) ve daha düşük olasılıklar elde etmek mümkündür. Ancak, dünyada 12 milyon eş yumurta ikizi bulunduğu için bu teorik olasılık hesabı aslında faydasızdır. Örneğin, rastgele seçilmiş iki kişinin aynı DNA'ya sahip olma olasılığı sadece 3 trilyonda birdir.

4. AmpFLP
Çoğaltılmış parça uzunluğu polimorfizmi (İng. amplified fragment length polymorphism veya AmpFLP) adlı bir diğer teknik, 1990'lar başında uygulamaya sokulmuştur. Bu teknik RFLP'den daha hızlı çalışır ve DNA örneklerini çoğaltmak için PCR kullanır. Değişken sayılı bitişik tekrar (İng. variable number tandem repeat veya VNTR) polimorfizmlerine dayalı aleller ayırdedilir, bunlar poliakrilamit jel elektroforezi ile ayrıştırılır. Bantlar gümüş boyaması ile görülür. Parmakizlemesi için sıkça kullanılan lokuslardan biri D1S80 lokusuydu. PCR'ye dayalı diğer yöntemler gibi, fazla bozunmuş DNA veya çok düşük miktarlarda DNA alel kaybına yol açabilmekte (öyle ki heterozigotik bir örnek homozigotik zannedilebilir) veya başka stokastik etkilere yol açabilmektedir. Buna ilaveten, analiz jelde yapıldığı için, çok yüksek sayılı tekrarlar jelin tepesinde sıkışabilirler ve birbirlerinden ayırdedilmeleri zor olabilir. AmpFLP analizi yüksek oranda otomatikleştirilebilir. Bu yöntemle kişisel DNA örnekleri karşılaştırılarak filogenetik ağaçlar yaratılabilir. Düşük maliyeti, hazırlanma ve çalıştırma kolaylığı gibi nedenlerden dolayı AmpFLP hâlâ az gelirli ülkelerde yaygın olarak kullanılır.

5. Y kromozom analizi
Y kromozomunun polimorfik bölgelerini hedefleyen primerlerin geliştirilmesi sayesinde, erkek ve kadından elde edilmiş karışık ve/veya ayrıştırılamayan örneklerin çözümü mümkün hâle gelmiştir. Y kromozomu babadan oğula aktarılır, dolayısıyla baba taraflı akraba olan erkeklerin tespitinde yardımcı olur. Sally Hemmings vakasında Amerikan başkanlarından Thomas Jefferson'un bir kölesinden çocuk sahibi olmuş olduğu göstermek için Y-STR analizi analizi kullanılmıştır.

6. Mitokondri analizi
Çok bozunmuş DNA örneklerinde CODISTe bulunan 13 STR'sinin tam bir profilini elde etmek bazen imkânsız olabilir. Bu tür durumlarda mitokondriyal DNA (mtDNA) tiplemesi yapılır çünkü hücreden mtDNA'nın pekçok kopyası vardır, oysa çekirdek DNA'sının 1-2 kopyası bulunur. Adlî bilimciler mtDNA'nın HV1 ve HV2 bölgelerini PCR ile çoğaltırlar, bu bölgeleri dizilerler, sonra tek nükleotit farklılıkları bir referans diziyle karşılaştırırlar. Mitokondriyal DNA anneden kalıtıldığı için birbiriyle doğrudan anne bağlantılı akrabalar eşleştirme referansı olarak kullanılabilir; örneğin birisinin anneannesinin kızının oğlu aynı mtDNA'ya sahiptir. Bir veya iki nükleotitlik bir fark, bir şüpheliyi dışlamak için yeterli sayılır. Heteroplazmi ve poli-C farklılıkları dizilerin doğrudan karşılaştırılmasını yanıltabilir, bu yüzden analistin belli bir uzmanlık seviyesinde olması gerekir. mtDNA kesin kimlik tespiti gereken durumlarda yararlıdır, örneğin anne tarafından bir akraba bulunabilen kayıp kişi vakalarında. mtDNA testi kullanılarak Anna Anderson'un iddia ettiği gibi Rus prensesi Anastia Romanov olmadığı belirlenebilmiştir. mtDNA, saçlardan ve eski kemik ve dişlerden elde edilebilir.

MsXLabs Üye Girişi