KROMATOGRAFİ
Kromatografi, birbirine yakın özellikteki madde karışımlarını ayırmak için kullanılan güçlü bir ayırma ve saflaştırma yöntemidir.Genel olarak tanımı ise, Kromatografi, bir karışımın sabit bir faz üzerinde ( gözenekli ) , hareketli bir çözücü yardımıyla , karışımı oluşturan bileşiklerin farklı hareketleri sonucu bileşenlerine ayrılması olarak tanımlanır . Kromatografide sabit ve hareketli olmak üzere iki faz vardır. Sabit faz katı ve sıvı hareketli faz sıvı ve gaz olabilir. Ayrımı istenen karışım hareketli faz yardımıyla sabit faz üzerinden geçirilir. Karışımı oluşturan bileşikler sabit faz tarafından farklı ölçüde tutulması nedeniyle her bir bileşik sistemi farklı zamanlarda terk eder. Böylece bileşikleri birbirinden ayırmak, tanımak ve ayrı ayrı toplamak olasıdır.Kromatografi farklı şekillerde sınıflandırılabilirse de ,esas olarak adsorbsiyon (yüzeyde tutma) ve partisyon (dağılma) mekanizmaları üzerinden yürür .
KROMATOGRAFİ MEKANİZMALARI
1.ADSORBSİYON KROMATOGRAFİSİ
Katı veya sıvı moleküllerin , sıvı veya gaz moleküllerini çekim kuvvetleri yardımıyla yüzeyde tutmasına adsorbsiyon denir. Burada sözü edilen adsorbsiyon fiziksel adsorbsiyondur. Zayıf van der waals ,elektro statik çekimler ve dipol –dipol etkileşimleri ne dayanır ,tersinirdir.
Adsorbsiyon kromatografisinde ayırım, karışımı oluşturan farklı bileşiklerin sabit faz yüzeyinde değişik derecede adsorbe olmaları ilkesine dayanır. Sabit faz katı, hareketli faz sıvı veya gazdır.. Sabit faz olarak alümina (Al2O3), silikajel (SiO2), talk ve bunun gibi gözenekli maddeler, hareketli faz olarak alkol, aseton,kloroform gibi bütün organik çözücüler kullanılabilir. Sabit ve hareketli fazın seçimi ,ayırımı yapılacak bileşiklerin polaritesine kimyasal özelliklerine bağlı olarak yapılır.Genelde polar maddeler için polar çözücüler apolar maddeler için apolar çözücüler kullanılır.
Çeşitli maddelerin adsorblayıcı veya sabit faz üzerinde adsorblanma dereceleri farklı olduğundan ,farklı yerlerde toplanırlar. En fazla adsorblanan maddelerin sürüklenmesi ve hareketleri daha zayıf daha yavaş, tersine az adsorblananların hareketleri ve sürüklenmeleri hızlı olur.
2.DAĞILIM (PARTİSYON) KROMATOGRAFİSİ
Dağılım, bir karışımdaki maddelerin birden fazla çözücü içerisindeki çözünürlükleri oranında dağılmasıdır. Bu, çözücünün ve maddenin özelliklerine bağlı bir fonksiyondur.Bu kromatografide ayırım çözünürlük esasına göre karışımın sabit ve hareketli faz arasındaki dağılımına dayanır. Bu yöntemde, sabit sıvı faz, yüksek yüzey alanlı gözenekli bir katı destek maddesine emdirilmiştir. Hareketli faz ise sıvı veya gazdır. Ayırımı gerçekleştirilecek bileşikler hareketli ve sabit faz sıvılarında farklı çözünürler. Çözünürlük farkından dolayı bileşikler sistemi önce veya sonra terkederler. Çözünürlüğü sabit fazda olan bileşikler sistemde daha uzun süre tutulduğu için sistemi daha geç terk ederler.
KROMATOGRAFİK YÖNTEMLERİN HAREKETLİ VE SABİT FAZIN CİNSİNE GÖRE SINIFLANDIRILMASI
1.KAĞIT KROMATOGRAFİSİ
Uygulaması en basit ve en çok kullanılan yöntemlerden biri olan kağıt kromatografisi genellikle süzgeç kağıtları kullanılarak yapılır.Burada etkin mekanizma dağılmadır. Çünkü dağılma kromatografisindeki sabit fazın yerini burada özel olarak yapılmış olan İngiliz Whatman,Alman Schleicher ve Schull v.b gibi markalardan oluşan bir süzgeç kağıdı almaktadır. Süzgeç kağıdı suyu çok kolay ve kuvvetle adsorbladığından yapılarında doğal olarak bir miktar su içerir ve sabit sıvı faz rolünü oynar. Kağıda uygulanan maddeler karışımının birbirlerinden ayrılmaları, kağıt üzerinde hareket eden çözücüyle kağıdın içerdiği su arasındaki dağılma farkına bağlıdır.
Analizi yapılacak madde çözelti halinde olmalı ve katılar uygun bir çözücüde çözünmelidir. Çözeltiler belli bir konsantrasyonda olmalıdır, en az %1’lik çözelti kullanılmalıdır.
Kağıt kromatografisinde analiz şöyle yapılır:
Analizi yapılacak madde çözeltisinden ince cam kapiler ile bir miktar alınıp, istenilen ebatta kesilen whatman yada diğer marka kromatografi kağıdının altından küçük lekeler halinde damlatılır. Kağıda hareketli fazın ilerleme sınırı işaretlenir. Hareketli faz çözücüsü karışımdaki maddelerin yapısına ve tecrübelere dayanılarak seçilir. Kağıt çözücüyü emer ve çözücü kağıt üzerinde ilerlerken lekenin içerdiği farklı bileşikleri farklı yerlere kadar taşır. Maddeler renkliyse, lekeler kolaylıkla görülür. Renksiz bileşikler görülemeyeceği için karışımdaki bileşiklerle renk verecek özel ayıraçlar kağıda bir spreyle püskürtülür veya U.V. lambası altında bakılır.
Ayrılan maddeler görülür hale getirildikten sonra çözücü yardımıyla madde içerisindeki farklı bileşiklerin belli noktalara ilerlediği gözlenir. Her maddenin hareketli faz ile sürüklenmeleri farklıdır. Böylece her madde için uygulanan koşullar belirtilerek karakteristik değerler verilebilir. Buna sürüklenme derecesi veya alıkonma faktörü denir ve Rf ile gösterilir.
Rf = Maddenin ilerlediği uzaklık(cm) / Çözücünün ilerlediği uzaklık(cm) = a / b
Rf bir madde için aynı sabit faz ve aynı çözücü için sabittir. Önceden belirlenen Rf değerleri ile bilinmeyen çözelti içerisinde hangi maddelerin bulunduğu belirlenebilir.
2.İNCE TABAKA KROMATOGRAFİSİ
İnce tabaka kromatografisi ,yapılış tekniğine göre kağıt kromatografisine benzer. Bu kromatografi türünde sabit faz olarak silikajel(SiO2), alüminyumoksit(Al2O3) ,toz selüloz gibi maddeler kullanılır.Burada etkin mekanizma adsorbsiyondur.
İTK’ de özel olarak hazırlanmış cam,alüminyum veya plastik levhalar kullanılır. Bu levhaların üzeri silikajel ,alümina gibi bir adsorbanla kaplanmıştır.Bu plakalar hazır olarak satılabildiği gibi laboratuvardada hazırlanabilir.Cam levhaların boyutları 5x20cm ile 20x20cm arasında değişir.Adsorblayıcı tabakanın kalınlığı yapılacak analizin cinsine göre değişir, bu kalınlık 0.25-2mm arasındadır. Plakalar kullanılmadan önce 110oC deki etüvde 2saat kurutularak aktifleştirilir ve hemen kullanılır.
Örneklerin plakalara uygulanması ve geliştirme kağıt kromatografisinde olduğu gibidir. İnce tabaka kromatografisinde geliştirme aşağıdan yukarıya doğru yapılır. Plakanın tanka yerleştirilmesinden önce tank atmosferinin çözücü buharıyla doymuş olmasına dikkat edilir. Ayrılan maddelerin lekelerinin belirlenmesi ve kullanılan reaktifler kağıt kromatografisinde olduğu gibidir .
3.KOLON KROMATOGRAFİSİ
Kolon kromatografisi ilk uygulanan kromatografik yöntemdir ve kromatografinin başlangıcıdır.Bu kromatografide sabit faz olarak silikajel(SiO2) ,selüloz, alüminyumoksit(Al2O3), zeolit ,kalsiyumkarbonat v.b.gibi aktif yüzeyli maddeler, hareketli faz olarak da organik çözücüler kullanılır. Bu yöntemde ayrımı yapılacak karışım uygun bir çözücüde çözülerek bir kolon içine doldurulmuş katı sabit fazdan geçirilir.Kolonda bileşenler sabit faz tarafından adsorblanırlar .Sonra ayrılacak karışımın çözüldüğü çözücü yada farklı polaritedeki çözücü veya çözücü karışımları kolondan geçirilerek bileşenler kolonun altından ayrı ayrı alınır.Çözücüsü buharlaştırılarak saf madde elde edilir.
4.GAZ KROMATOGRAFİSİ Gaz kromatografisi, diğer kromatografiler gibi bir karışımda bulunan maddeleri ayırmaya yarar. Diğer kromatografilere göre avantajı sonuçların çabuk elde edilmesi ve ucuz olmasıdır. Gaz kromatografisi ikiye ayrılır.
Gaz-Katı Kromatografisi:
Bu kromatografide de iki faz vardır. Sabit faz olarak yarıçapı küçük uzun bir kolon içine yerleştirilmiş geniş yüzeyli dolgu maddeleri(adsorban=silikajel,alümina vb.), hareketli faz olarak da dolgu maddelerinin arasından kolaylıkla geçebilen gaz kullanılır. Genellikle taşıyıcı gaz olarak azot veya helyum gazları kullanılır.
Gaz-Sıvı Kromatografisi:
Burada sabit faz, gaz –katı Kromatografisindeki geniş yüzeyli dolgu maddelerine emdirilmiş bir sıvı(yüksek mol kütleli polimerler) ve hareketli faz gazdır.
Gaz kromatografi aleti oldukça basittir. Sistem belli başlı 5 kısımdan oluşur.
Ayırımı istenen karışım, bir enjektör yardımıyla enjeksiyon kısmına enjekte edilir. Enjektör bölümü ısıtılmış durumdadır, karışım hemen buharlaşır ve buhar halinde inert taşıyıcı gaz ile birlikte kolona girer. Kolonda her bileşik kaynama noktasına, molekül büyüklüğüne ve kolondaki sabit faz ile etkileşimine bağlı olarak kolonda farklı hızlarda göç ederek devamlı taşınırlar ve böylece birbirlerinden ayrılarak farklı zamanlarda kolondan çıkarlar. Kolondan çıkan herbir bileşen dedektöre girer, dedektörde bileşenlerin miktarı ile orantılı olarak belirlenir ve kaydedicide grafik olarak çizilir. Her bileşik alıkonma zamanı ile belirlenir. Alıkonma zamanı bir bileşiğin enjekte edilmesinden dedektörden çıkışına kadar geçen süredir. Bu süre her bileşik için farklıdır. 5.YÜKSEK PERFORMANSLI SIVI KROMATOGRAFİSİ
Kısaca HPLC (High Performance Liquid chromatography) olarak isimlendirilir.Eski kromatografi türlerinin iyileştirilmiş ve hızlandırılmış şeklidir.Burada da kolon bir aletin içine yerleştirilmiştir.İşleyiş olarak gaz-sıvı kromatografisine benzer,yalnız burada hareketli faz sıvıdır.HPLC cihazında farklı kolonlar kullanılarak dört farklı mekanizma uygulanabilir.
Bunlar: 1-Adsorbsiyon Kromatografisi
2-Dağılma Kromatografisi
3-İyon Değiştirme Kromatografisi
4-Jel Geçirgenlik Kromatografisi
Adsorbsiyon ve dağılma kromatografileri sayfa 2ve 3 de anlatılmıştı.
İyon Değiştirme Kromatografisi:Bu yöntemde sabit faz anyon ve katyon değişimi yapabilecek gruplar içeren reçineler ,hareketli faz ise tamponlanmış sıvılardır.Örneğin; yapısındaki Na+iyonundan dolayı doğal bir reçine olan zeolit (Na2AL2Sİ4O12) katyon değiştirmede kullanılır.
Jel Geçirgenlik(moleküler eleme) Kromatografisi:Bu yöntem doğal ve yapay polimer karışımlarını ayırmada kullanılır.Buyöntemde sabit faz gözenekli bir reçinedir.Reçineler büyük molekül ağırlıklı polimer maddelerdir. Gözeneklere girip çıkan küçük moleküller kolonu daha geç terk eder,gözeneklere girmeyen büyük moleküller kolonu önce terk ederek ayrılırlar.Burada ayırma molekül büyüklüğüne göredir.
