I. Kilise İmparator Constantinos 'un (324–337) oğlu imparator Constantios (337–361) tarafından 360 yılında yaptırılmıştır. Bu kilise bazilikal planlı ve ahşap çatılıdır. Kilise 404 yılında İmparator Arcadios'a karşı, çıkan halk ayaklanmasında kısmen yakılmış ve harap olmuştur.

II. Kilise İmparator II. Theodosios (408–450) tarafından Mimar Ruffinos 'a 415 yılında inşaa ettirilmiştir. Bu yapı da yine bazilikal planlı, ahşap çatılı, 5 nefli ve 3 kapılı anıtsal girişli bir yapıdır. II. Ayasofya da İmparator Iustinianos ( 527–565) aleyhine 532 yılında başlayan ve tarihte Nika ayaklanması olarak adlandırılan isyan sonucunda yanmış ve yıkılmıştır.

Bugünkü Ayasofya İmparator Iustinianos tarafından dönemin iki önemli mimarı olan Miletos'lu (Milet) Isidoros ile Tralles'li (Aydın) Anthemios 'a yaptırılmıştır. Binanın yapımına 23 Şubat 532 tarihinde başlanmış,1000 usta ve 10.000 işçi ile 5 yılda tamamlanmış, 27 Aralık 537 yılında ibadete açılmıştır.

Ayasofya'da VI. yüzyılda yapılan orjinal tavan mozaiklerinin bitkisel ve geometrik motifli olanları günümüze kadar ulaşmış, ancak tasvirli mozaikler ikonaklazma akımının bitiminden sonra yapılmıştır.

Ayasofya Fatih Sultan Mehmet tarafından İstanbul'un 1453 yılında fethi ile birlikte camiye çevrilmiş, çeşitli tarihi belgelerde harap durumda olduğu belirtilen yapı İstanbul'un fethinden sonra hiçbir tahribata uğratılmadığı gibi, yapılan güçlendirme ve onarımlarla günümüze kadar en iyi şekilde korunmuştur. Ayrıca Osmanlı mimari unsurları ile yapılan ilave ve eklerle de kutsal bir mekân ve ibadethane olarak varlığını sürdürmüştür.

Yapının içine XVI. ve XVII. yüzyıllarda minber, mihrap, vaaz kürsüleri, ahşap korkuluklar ilave edilmiştir. Sultan I.Mahmut döneminde kütüphane yaptırılmıştır. Burada yer alan çiniler XVI. yüzyılın seçkin örneklerindendir.

Farklı dönemlerde minareler, Ayasofya avlusu içerisinde I. Mahmut tarafından şadırvan ve Sıbyan mektebi ve Sultan Abdülmecit döneminde muvakkithane yaptırılmıştır. Ayasofya'nın güney avlusunda III. Murat türbesi, Sultan III. Mehmet türbesi, Sultan II. Selim Türbesi, Şehzadeler Türbesi inşaa edilmiştir. Bizans döneminde Vaftizhane olan yapı ise Sultan I. Mustafa ve Sultan İbrahim türbesi haline getirilmiştir. Fatih Sultan Mehmet'in Ayasofya'yı camiye çevirdikten sonra kuzey tarafına bir medrese inşa ettirdiği bilinmektedir.

Ayasofya 24 Kasım 1934' te Mustafa Kemal Atatürk'ün önerisi ve Bakanlar Kurulu kararı ile müzeye dönüştürülerek 1 Şubat 1935' te ziyarete açılmıştır.