Işık Mikroskopu

Mikroskop, çeşitli merceklerin kullanılması ve bu merceklerin düzenlenmesi ile objelerin görüntülerinin büyütülmesine olanak veren ve biyolojik araştırmalarda sıklıkla kullanılan bir alettir. Mikroskobun bir diğer önemli işlevi, objelerin büyütülmesini sağlarken, dereceli bir şekilde büyütülen objelerin çözünürlüğünü veya netliğini de artırmaktadır. Dolayısıyla, mikroskop objelerin büyütülmesi ve aynı anda dereceli bir şekilde objelerin çözünürlüğünü artırmaktadır. Görüntü büyütülmesi ve çözünürlük eş zamanlı düşünülmesi gereken iki olaydır.
Mikroskoplarda, çözünürlük ve görüntü büyütülmesi, ışık ve mikroskop lensleri ile

sağlanmaktadır. Lensler, kullanılan ışığı çeşitli amaçlar için yönlendirmemizi sağlamaktadır. Görüntü büyütülmesi (magnification), sanıldığının aksine, çözünürlük ile bire bir ilişkili değildir. Çözünürlük ile bağıntıyı aşağıdaki formül güzel bir şekilde özetlemektedir.
Sayısal açıklık (numerical aperture), kullanılan lensin ışık toplama kapasitesinin, sayısal ifadesidir. Daha ayrıntılı bahsetmek gerekirse, N.A, belirli bir lensten yayılan ışığın açısının, geometrik olarak hesaplanmasıdır. Kullanılan objektif lensleri, N.A özelliklerine göre işaretlenmişlerdir. N.A ile çözünürlük arasında doğrusal orantı vardır. Bir başka deyişle, N.A değer yüksek olan bir lensin, çözünürlüğü de yüksektir.
Kırılma indeksi (n) (refractive index), ışığın kırılmadan, ne kadar iletildiğini/yayıldığını belirten sayısal bir ifadedir. Başka kelimelerle ifade etmek gerekirse, yayılan ışığın, kırılan ışığa oranını belirtmektedir. Kırılma indeksini belirten n değeri, kullanılan lensin ışık toplama kapasitesini ifade eder. Bir başka deyişle, n değeri ne kadar yüksekse, kullanılan lensin ışık toplayabilme kapasitesi o kadar büyük demektir. Örnek vermek gerekirse, yağın kırılma indeksi havaya göre daha büyüktür (yağ=1.5, hava = 1.0)
Görüntünün mikroskop ile görülebilmesi için, yüksek düzeyde kontrast gerekmektedir. Kontrastın, ışık yoğunluğu ve ışığın lenslerden geçme açısı değiştirilerek, ayarlanması mümkündür. Işığın aydınlatma merceğinden ( condensor) gelme açısı, mikroskopta bulunan
ve diyafram diye tabir edilen (phase rings) bölümü ile ayarlanmaktadır. Kontrastı ayarlamada kullanılan bir başka yöntemde, aydınlatma kaynağının önüne konabilen filtrelerdir. Dahası, incelenecek olan örneğin çeşitli kimyasallar ile boyanması ile de kontrastı güçlendirmek mümkündür.

Mikroskop çeşitleri

Lensler, filtreler ve ışık kaynağı, detaylı bir şekilde incelenmek istenen görüntünün, büyütülmesi ve çözünürlüğünün arttırılması için kullanılmaktadır. İncelenmek istenen materyale göre ve sorulan bilimsel sorunun niteliğine göre, kullanılacak olan mikroskop seçilmelidir.

Aydınlık Saha Mikroskobu

Kullanım: Kanlı ve sabitlenmiş doku örneği, hücreler ve mikroorganizmalar Avantajları: Kullanımı kolay
Nasıl çalışır: Aydınlık saha mikroskobu, standart ışık mikroskobudur. Maksimum aydınlanmanın ulaşılması hedeflenmiştir (Koehler aydınlatması)
Görünüm: Beyaz arka plan üzerinde, gri veya koyu renk görüntü.
Ne zaman ihtiyaç duyulur: Prokaryot veya ökaryot organizma ile çalışılmak istendiğinde.
Gereksinim: 10X ve 40X objektif lensleri, 10X (oküler) göz merceği ve Işık kaynağı olan herhangi bir ışık mikroskobu

Karanlık Saha Mikroskobu

Kullanım: Yansıtılmış ve kırılmış ışık ile boyanmamış ıslak örneklerdeki küçük yapıları gözlemlememizi sağlar.
Avantajları: Düşük kontrastlı veya boyanmamış örnekleri gözlemlememizi sağlar
Nasıl çalışır: İncelenmek istenen örnek, sadece gözlemlenmek istenen objelerin ışık kırınımlarına müsaade edecek bir biçimde aydınlatılır. Bu sayede, arka plan görünmez.
Görünüm: Koyu renkli arka planda, aydınlanmış objeler olarak görülür
Gereksinim: Karanlık alan engelleyicisi olan bir ışık mikroskobu. Engelleyici, mikroskop tablasının altında kalan kısımdaki yoğunlaştırıcının altına ki, filtre tutucusuna yerleştirilir.
Özel kondansör ve objektiflere ihtiyaç duyar, ışık alttan veya reflected olarak üstten uygulanabilir. Reflekted karanlık sahada objektifler LWD (Long working Distance), uzun çalışma mesafesi UL-->VD ve EL-->VD (Ultra-Long Working Distance), (Extra-Long Working Distance) olarak belirlenir.

Polarizasyon mikroskobu

Rutin parlak saha ışık mikroskobisindeki polarizasyon mikroskobunda polarizör ve analizör olmak üzere iki filtre bulunur ve ışık patikasına yerleştirilir. Polarizör tablanın altında ışık kaynağının üstünde bulunur, 360 derece döndürülme imkanı vardır, soldan sağa veya doğu batı yönünde vibrasyona izin verir. Analizör ise genellikle kuzey güney yönde düzenlenmiştir ve objektifin üzerinde bulunur. Bazı sistemlerde analizörde döndürülebilir. Kullanılmadığında ışık patikasından çıkarılabilir. Özellikle amiloid birikimlerinin Kongo kırmızısı boyamasında elma yeşili refle vermesinde önem taşır. Ayrıca dokudaki kristaller polarizasyon ile çok kolay tanınabilir.

Faz-Kontrast Mikroskobu

Kullanım: Islak, boyanmamış ve lam- lamel arasına yerleştirilmemiş örnekleri, kontrast yardımıyla gözlemlememizi sağlar
Avantajları: Sabitlemeye ve boyamaya ihtiyaç yoktur
Nasıl çalışır: İki filtre eş zamanlı olarak kullanılır. Birinci filtre, çerçeveden gelen ışık haricindeki ışıkları engeller, ikinci filtre ise birinci filtreden kaynaklanan ayna görüntüsündeki, çerçeveden gelen ışığı engeller. Dolayısıyla, direk ışık engellenir ve direk olmayan, kırılarak dağılan ışık örneğe ulaştırılır.
Görünüm: Koyu renk ve açık gri renk görüntüler
Gereksinim: İki engelleyici filtre kullanılır. Bir tanesi yoğunlaştırıcının altına, diğeri objektif düzeneğinin içine monte edilmiş olmalıdır

Nomarski Görüntülemesi (DIC)

Kullanım: Saydam olan ve hücre içindeki bölümleri gözlemlememizi sağlar.
Avantajları: Örneklerin sabitlenmesine ve boyanması gerekmemektedir, dolayısıyla canlı doku örnekleri veya hücrelerin gözlemlenmesine olanak sağlar.
Nasıl çalışır: Örneğin içinden geçen ışık, faz değişimleri meydana getirir. Bu faz değişimleri genlik farklarına dönüştürülür ve daha yüksek kontrast oluşturulmasına olanak verir.
Görünüm: Üç boyutlu görüntü.
Gereksinim: Özel olarak tasarlanmış objektif lensleri.

Flüoresans ( Flöresan )Mikroskobu

Kullanım: Mikro organizmaların veya hücrelerin bölümlerini incelemek ve işaretlemek için kullanılır
Avantajları: Normal ışık ile gözlemlenmesi olanaksız olan, organ veya hücre bölümlerini görmemizi sağlar
Nasıl çalışır: Örnekler, flüoresans molekülleri ile işaretlenir. İşaretlenen bu moleküllerin uyarılmasıyla, yayılan ışık, filtreler ile işlenerek, renk ve kontrasta dönüştürülür.
Görünüm: Koyu bir arka plan ve canlı renkler
Gereksinim: Özel objektif lensi, uyarılabilen ışık kaynağı, kullanılan flüoresans boyalarına uygun optik lensler.
Civa veya ksenon arklı güçlü ışık kaynakları ile mümkün olur. Özel filtreler yardımı ile belli dalga boyunda aydınlatılan doğal yada yapay olarak boyanmış flöresan ışık veren maddeler incelenir. Siyah zeminde flöresan veren yapılar değerlendirilir.
Genelde reflected- yansıtmalı teknik kullanılır. Civa arklı lambanın belli bir dalga boyundaki ışığı araştırılan doku üzerine yönlendirilir. Bu ışıkta renk veren otoflöresan veya boyalı maddeler siyah zeminde flöresans verir. Burada basit olarak FITC ile işaretli monoklonal antikorlar kullanılabileceği gibi digital fotografi yardımıyla üstü üste bindirilen fotograflarla farklı filtre setleri kullanılarak çoklu flöresan boyama (FİSH) yapılabilir. Özel flörid objektifler kullanılması daha uygundur.

Ter (Inverted) Mikroskop

Kullanım: Flasklardaki ve çukur kaplardaki (dish) canlı hücrelerin morfolojilerini ve kaplardaki yapışmış hücre örneklerinin doğal hallerinde (in situ) boyanmış görüntülerinin incelenmesi için kullanılır Avantajları: Uzak çalışma mesafesi
Nasıl çalışır: Flaskların ve tabakların, yerleşimi için Yoğunlaştırıcı (condenser), objektifin üzerinde bulunmaktadır.
Görünüm: Koyu ve açık renk gri görüntüler
Gereksinim: Inverted mikroskop Faz-kontrast yoğunlaştırıcı, faz-kontrast objektifleri. 40X veya daha büyük objektif.

Konfokal (confocal) Mikroskop

Kullanım: Organellerin, hücre iskeleti elementlerinin ve makro moleküllerin, hücre içindeki konumlarını belirlemek için kullanılır.
Avantajları: Sığ alan derinliği ile odak dışı parlamalar engellenir ve arka plan yoğunluğu azaltılır.
Nasıl çalışır: Flüoresans boyalarıyla, işaretlenmiş moleküller, lazer tarafından taranır. Taranan imgeler tekrardan işlemden geçirilerek, üç boyutlu görüntü elde edilir.
Görünüm: Çözünürlüğü arttırılmış, standart flüoresans görüntü
Ne zaman ihtiyaç duyulur: Arka planın karmaşık olduğu, konum belirleme çalışmaları ( örnek olarak, bakterinin veya proteinin hücre içindeki yerini tespit etmek için)
Gereksinim: Konfokal mikroskop ve bilgisayar

ELEKTRON MİKROSKOPU

Elektron mikroskop örneğin elektronik olarak büyütülmüş görüntüsünü oluşturan bir mikroskop tipidir. Örneği görüntülemek için elektron partiküllerini kullanır ve büyütülmüş görüntü oluşturur. Optik ışık mikroskobuna göre görülebilir (foton) dalga boyu 100,000 kez küçük olduğundan 1,000,000 kat büyük görüntü oluşturabilir, optik mikroskobun büyütmesi ise 2,000 kat ile sınırlıdır. Görüntü oluştururken, elektron akımını kontrol etmek ve odaklamak için elektrostatik ve elektromagnetik “lens”ler kullanır.
Optik mikroskop kalitesinde olan ilk elektron mikroskop 1933 te Ernst Ruska tarafından oluşturuldu. Patent ise 1931 yılında Siemens tarafından alınmıştı, Rutka 1937 yılında Siemens ile çalışmaya başladı, 1939 da ilk ticari geçirgen elektron mikroskop (Transmission Electron Microscope (TEM)) ortaya çıktı.

Elektron mikroskobu, aydınlatma kaynağı olarak, ışık yerine elektronları kullanmaktadır. Elektronların dalga boyu 0.04 nm’dir, görünebilen ışığın dalga boyundan yaklaşık 10000 kez daha küçüktür. Elektronların dalga boyu, görünür ışığın dalga boyundan daha kısa olduğundan, elektron mikroskobunun olanak sağladığı büyütme oranı ve çözünürlük, standart ışık mikroskoplarına oranla daha fazladır. Elektronlar kullanılarak erişilen görüntü büyütmesinin temel mekanizması, ışık kullanılan mekanizmalara benzemektedir ancak elektron mikroskobu için uygulanılan teknolojiksel yaklaşım farklıdır. Elektron mikroskoplarında, elektronlar, elektron tabancasında üretilirler ve vakum tüpünde dolaştırılır ve hızlandırılırlar. Elektron huzmesinin odaklanması için, cam lenslerin yerine elektro mıknatıslar kullanılmaktadır. Cam lensler sadece ilgili görüntünün büyütülmesi işlemi için kullanılmaktadır.
Elektron mikroskobunun kullanılması ve görüntü işlemi için örneklerin hazırlanması, standart mikroskoplar ile karşılaştırıldığında daha karmaşıktır. Bunun için elektron mikroskopları için özel görevliler ve elektron mikroskobu için ayrı üniteler atanmıştır.

Transmisyon Elektron Mikroskobu (TEM)

Kullanım: Hücre içindeki yapıları detaylı incelenmesini sağlar
Avantajları: Yüksek çözünürlük. Konumlama çalışmaları için immünolojik işaretleme yöntemi ile birleştirilerek kullanılması mümkündür
Nasıl Çalışır: Tungsten kaynak elektronları üretir. Elektronlar vakumda hızlandırılarak, elektro mıknatıslar ile sabitlenmiş, bölümlere ayrılmış ve boyanmış örnek üzerine odaklanması sağlanır. Görüntünü, film üzerinde veya fosforlu ekran üzerinde yakalanır.
Görünüm: Çapraz kesit şeklindeki siyah ve beyaz görüntüler
Gereksinimler: Transmisyon elektron mikroskobu
Transmisyon elektron mikroskop; Yüksek voltajlı elektron akımı imaj oluşturmak için kullanılır, Elektron tabancası elektronları yayar, elktron kaynağı tungsten Flamanlı bir katoddur. Elektron ışınları +100 keV (40 to 400 keV) anod ile hızlandırılır, elktrostatik ve elektromagnetik lensler ile odaklanır ve incelenecek örneğin içinden geçer. Dışarı çıkan ışınlar mikroskopun objektif lens sistemiyle büyütülür ve bu bilgi flöresan görüntüleme ekranına aktarılır. Görüntü olarak değişik ortamlarda depolanır. CCD kamera ile yakalanan görüntüler bilgisayar veya monitorlerde görüntülenebilir. TEM görüntülerde de sferik aberrayonlar sınırlayıcıdır, yeni jenerasyon düzelticiler ile bu düzeltilip rezolüsyon artırılmıştır. Yüksek rezolüsyonlu TEM’lerde (High Resolution TEM HRTEM) rezolüsyon 0,5 Angstrom (50 picometre) altına inmiştir (50 milyon büyütme).

Taramalı (scanning) Elektron Mikroskobu (SEM)

Kullanım: Hücre dışındaki bileşenleri ayrıntılı olarak incelememizi sağlar
Avantajları: Yüksek çözünürlük. (Çözünürlük TEM’e göre daha düşüktür)
Nasıl Çalışır: Örnek, odağı sabitlenmiş elektron huzmesi ile taranır. Örneğe çarpan elektron geri yansır ve yansıyan elektronlar, mikroskop tarafından algılanır ve TV görüntüsü şeklinde çevrilir.
Görünüm: Hücre dışının üç boyutlu görünümü.
Gereksinimler: Taramalı elektron mikroskobu
Taramalı elektron nikroskop (Scanning electron microscope (SEM)) TEM’den farklı olarak SEM’in elektron ışınları örneğin tam görüntü bilgisini içermez. Örnek dört tarfından elektron ışınları ile taranır ve örneğin her köşesinde elektron demetleri enerji kaybeder ve kayıp enerji ısı, ışık, elektronlara sekonder düşük enerji, veya x ışınına çevrilir. Örnekte enerjinin oluştuğu bölüme göre bu sinyallerin yoğunluğunun görüntüsü SEM görüntüsünü oluşturur. Genel olarak SEM imaj kalitesi TEM’e göre düşüktür. SEM görüntüsü örneğin yüzeyini gösterir.