ORGANİK ASİT KARIŞIMLARINDAN
RHODOBACTER SPHAEROIDES O.U. 001 İLE HİDROJEN ÜRETİMİ
Başar UYARa, Meral YÜCELb, Ufuk GÜNDÜZb, Lemi TÜRKERc, İnci EROĞLUd
aBiyoteknoloji Bölümü, bBiyoloji Bölümü, cKimya Bölümü, dKimya Mühendisliği Bölümü,
Orta Doğu Teknik Üniversitesi, İnönü Bulvarı, 06531, Ankara
ÖZET
Doğada en yüksek verimle hidrojen üreten bakteri grupları karbonhidratları kullanıp yan ürün olarak organik asit çıkaran fermentatif bakteriler ile organik asitleri kullanabilen fotosentetik bakterilerdir. Avrupa Birliği 6. Çerçeve Programı tarafından desteklenen Hyvolution Projesi kapsamında, bu iki aşamanın birleştirilerek bitki ve zirai atıklardan elde edilecek karbonhidratların yüksek verimle H2 ve CO2’ye dönüştürülmesini sağlayacak bir teknoloji geliştirilmesi hedeflenmektedir. Bu amaçla karbonhidrat fermantasyonu sonucu oluşan organik asit kompozisyonu belirlenmiş ve bu kompozisyona uygun miktarlarda organik asit içeren besiyerleri yapay olarak hazırlanmıştır. Fotosentetik bakteri olarak kullanılan Rhodobacter sphaeroides O.U. 001 anaerobik koşullarda ışık altında organik asitleri kullanarak hidrojenaz ve nitrojenaz enzim sistemleri ile moleküler hidrojen üreten mor kükürtsüz bir bakteri türüdür. Çok sayıda kesikli fotobiyoreaktörün paralel çalıştırılabildiği ve aynı anda çıkan gazın ölçümünün bir kamera ve yazılımla takip edilebildiği bir ölçüm sistemi geliştirilmiştir. Bu sistemde sağlanan kontrollü ortamda bu bakterinin fermentör çıktısına benzetilerek hazırlanan besiyerinde büyümesi, hidrojen üretimi ve organik asitleri tüketimi zamana karşı takip edilerek karşılaştırılmıştır. Sonuçlar Rhodobacter sphaeroides O.U. 001 ile, organik asitlerin büyüme ve hidrojen üretiminde kullanıldığını, dolayısıyla birleştirilmiş hidrojen üretim prosesi için uygun olduğunu göstermektedir. Bakteri önce asetatı, asetat tükenince propiyonatı ve son olarak bütiratı kullanmaktadır. Tüketim hızları açısından da asetat en hızlı şekilde, bütirat en yavaş şekilde kullanılmaktadır.
1. GİRİŞ
Fotosentetik bakterilerin anaerobik bakterilerle kombinasyonuyla karbonhidrat içeren atıklardan yüksek verimle hidrojen üretilmesini sağlayan bir sistem oluşturulabilir. Böyle bir sistemde ilk etapta organik atıklar anaerobik fermantasyonla organik asitlere çevrilir, ikinci etapta ise bu asitler fotosentetik bakterilerle hidrojene dönüştürülür [1]. Anaerobik fermantasyonda elde edilen asıl ürünler asetik ve bütirik asittir [2]. Diğer taraftan gıda atıklarından asidojenik kültürlerle yapılan hidrojen üretiminde de bütirik, asetik ve propiyonik asit elde edilmektedir [3]. Bu asitlerin fotosentetik bakterilerle hidrojene çevrilmesi enerji üretimini organik atık arıtımıyla birleştireceğinden önemlidir. Ancak, asetik ve bütirik asitten fotosentetik bakterilerle hidrojen üretimi hakkında pek az şey bilinmektedir [4,5], bu iki substrat bakteriler tarafından daha çok PHB üretimi için kullanılmaktadır [6].
Rhodobacter sphaeroides O.U. 001, anaerobik ortamda, ışık altında organik asitlerden nitrojenaz-hidrojenaz enzim sistemi ile hidrojen üreten mor sülfürsüz bir bakteridir.
Bu çalışmanın amacı Rhodobacter sphaeroides O.U. 001’in farklı organik asit karışımları içeren besiyerlerindeki büyüme ve hidrojen üretimini karşılaştırmaktır.
Bu çalışmalar fotofermantasyonun karanlık fermantasyon atık suyunu kullanabileceğini gösterecek ve böylelikle iki farklı sistemin birleştirilmesi mümkün olacaktır; böyle bir ikili sistem verimlilik ve maliyette büyük iyileşmeler sağlayacaktır.
Ayrıca çeşitli organik asitlerin karışımlarının denenmesi sırasında elde edilecek veriler (hidrojen üretimi, büyüme, besiyeri analizleri,diğer ürünlerin üretimi vb) bakterinin metabolizması konusunda da bilimsel olarak katkı sağlayacaktır.
Karanlık fermantasyon sonucunda elde edilen fermentör likörü bileşimini belirlemek için yapılan literatür araştırması sonuçları Tablo 1’de verilmiştir.
Tablo 1. Karanlık fermantasyondan sonra besiyerinin bileşimi
pH m/o tipi Kullanılan substrat asetik asit (mM) prop. asit (mM) butirik asit (mM) Referans
5 mezofilik kanalizasyon 11.1 1.4 34.5 Horuicihi et al 2002
6 mezofilik kanalizasyon 11.9 2.2 35.6 Horuicihi et al 2002
7 mezofilik kanalizasyon 21.0 2.7 32.4 Horuicihi et al 2002
8 mezofilik kanalizasyon 47.5 22.3 2.2 Horuicihi et al 2002
n/a mezofilik kanalizasyon 8.7 0.1 12.2 Hawkes et al 2005
n/a mezofilik kanalizasyon 16.7 8.1 31.8 Lay et al 1999
n/a mezofilik kanalizasyon 40.7 23.3 85.7 Lin et al 2005
5 termofilik Gıda atığı 1.1 0.0 10.5 Shina et al 2004
6 termofilik Gıda atığı 2.3 0.0 10.2 Shina et al 2004
7 termofilik Gıda atığı 4.2 0.0 7.4 Shina et al 2004
5 mezofilik Gıda atığı 3.1 1.9 7.1 Shina et al 2004
6 mezofilik Gıda atığı 6.8 4.9 3.3 Shina et al 2004
7 mezofilik Gıda atığı 8.7 6.2 2.0 Shina et al 2004
4 mezofilik Pirinç atığı 30.4 69.6 0 Fang et al 2005
5 mezofilik Pirinç atığı 35.4 57.4 3.6 Fang et al 2005
6 mezofilik Pirinç atığı 43 51.4 4 Fang et al 2005
7 mezofilik Pirinç atığı 48.4 42.3 7.8 Fang et al 2005
5 mezofilik kanalizasyon 83.3 33.8 238.6 Fascetti et al 1998
Tabloda görüldüğü üzere fermentör likörü kompozisyonu kullanılan besiyeri, bakteri tipi ve pH’a bağlı olarak değişmektedir. Ancak temel olarak asetik, propiyonik ve bütirik asit elde edilmektedir. Bunlara ek olarak çok az miktarda etanol da çıkmaktadır (tabloda verilmemiştir). Bu verilerden araştırmada kullanılacak organik asitlerin tipi ve konsantrasyonu belirlenmiştir. Tablo 2’de araştırılması planlanan miktarlar verilmiştir.
Tablo 2. Fotofermantasyonda kullanılmasına karar verilen besiyeri kompozisyonları
Sıra No Asetik asit (mM) Propionik asit(mM) Butirik asit(mM) Toplam C (mM) N kaynağı (mM)
1 10 5 8 67 2.23
2 10 5 32 163 5.43
3 10 23 8 121 4.03
4 10 23 32 217 7.23
5 40 5 8 127 4.23
6 40 5 32 223 7.43
7 40 23 8 181 6.03
8 40 23 32 277 9.23
2. YÖNTEM
Bu çalışmada R. sphaeroides O.U. 001 (DSM 5864) kullanılmıştır.
Kullanılan besiyeri Biebl ve Pfennig (Biebl ve Pfennig, 1981) tarafından önerilen genel amaçlı ortamın uyarlanmış hali olup inorganik tuzlarla beraber azot kaynağı olarak 2mM sodyum glutamat içermektedir, karbon kaynağının cinsi ve konsantrasyonu ise sonuçlarda belirtildiği şekilde değiştirilmiştir.
Fotobiyoreaktör olarak sızdırmaz kauçuk tıpalı 55 ml kültür hacmine sahip cam şişeler kullanılmıştır. Şişeler besiyeriyle tamamen doldurularak anaerobik ortam sağlanmıştır. Üretilen gaz şişenin tepesinden toplanıp biriktirilerek ObiTEK GasMaster Sistemiyle (referans) gerçek-zamanlı olarak izlenmiş, gaz üretim hızı ve miktarı hassas ve doğru bir şekilde takip edilmiştir.
Fotobiyoreaktörler 30-33ºC’de tutulmuştur. Besiyeri başlangıç pH’ı 6.7’dir.
Reaktörlerin ve besiyerinin sterilizasyonu otoklavla sağlanmıştır. Hücre büyümesi spektrofotometreyle, çıkan gazın kompozisyonu gaz kromatografi cihazı ile ölçülmüştür.
Deney kültür ortamı, logaritmik büyüme fazının ortasındaki R. sphaeroides O.U. 001’den hacimce %10 oranında ekim yapılarak oluşturulmuştur.
Fotobiyoreaktör tungsten lamba kullanılarak aydınlatılmış ve reaktör yüzeyinde 4000 lüks düzeyinde homojen bir ışık dağılımı gerçekleştirilmiştir. Işık şiddeti lüksmetre (Lutron) cihazı ile ölçülmüştür.
Analizler reaktörden alınan sıvı numunelerle gerçekleştirilmiştir: pH ölçümleri standart kombine pH elektrotları (Mettler-Toledo 3311) ve bir voltaj/pH dönüştürücüsü (NEL pHR1000 Transmitter) kullanılarak gerçekleştirilmiştir. Organik asit analizleri yüksek basınçlı sıvı kromatografisi (Varian ProStar HPLC) ile gerçekleştirilmiştir. Taşıyıcı faz olarak H2SO4 kullanılmıştır.
Numunelerin 660 nm’deki absorbansı bir spektrofotometrede (Jenway UV/VIS) ölçülmüş ve yapılan kalibrasyona göre kuru mikroorganizma / litre değerine çevrilmiştir.
3. SONUÇLAR
Tablo 2 de verilen kompozisyonlardan 2 ve 5 numaralı besiyerlerinde, ayrıca karşılaştırma amacıyla substrat olarak sadece asetat (30mM) ve sadece bütirat (15mM) içeren besiyerlerinde bakteri büyümesi, hidrojen üretimi, substrat tüketimi araştırması yapılmıştır.
Sonuçlar aşağıda verilmektedir:
Şekil 1. 30mM Asetik asit içeren besiyeri
Şekil 2. 15mM Bütirik asit içeren besiyeri
Şekil 3. 32mM Bütirik asit,10mM Asetik asit, 5mM Propiyonik asit içeren besiyeri
Şekil 4. 40mM Asetik asit, 8mM Bütirik asit, 5mM Propiyonik asit içeren besiyeri
Şekil 1 ve 2’de görüldüğü üzere bakterinin asetik asidi tüketim hızı bütirik asidi tüketim hızından daha yüksektir. Bununla birlikte asetik asit daha çok biyokütle artışı için kullanılmakta bu nedenle hidrojen üretimi bütirata göre düşük kalmaktadır. 3. şekilde görüleceği üzere substrat karışımlarında da bakteri en hızlı olarak ve ilk önce asetik asidi tüketmiş, müteakiben propiyonik asidi ve en son bütirik asidi kullanmayı tercih etmiştir.
4. Şekilde sonuçları verilen diğer besiyeri karışımında da asetik ve propiyonik asit ilk olarak tüketilmiş (asetik asit daha hızlı), bakteri bütirik asidi daha sonra tercih etmiştir.
Şekil 3 ve 4’ün birlikte yorumlanmasıyla bakterinin substratları sırasıyla asetik asit, propiyonik asit ve bütirik asit şeklinde tercih ettiği görülmektedir. Bu sıra substratların karbon miktarları (asetik asit 2C, propiyonik asit 3C, bütirik asit 4C) ile uyumludur. Dolayısıyla daha küçük subtsratların daha kolay metabolize edildiği söylenebilir. Ancak hidrojen üretimi bakteri büyümesiyle aynı oranda artmamakta, aksine substratın sınırlı olduğu durumda substratın biyokütle artışı için kullanılması hidrojen üretimini azaltmaktadır (Şekil 1 ve 2), bu aynı zamanda bakterinin yüksek konsantrasyonlarda kendi kendini gölgelemesinin de bir sonucudur.
Tablo 2’de belirtilen diğer organik asit karışımlarında hidrojen üretimi araştırmalarımız devam etmektedir.
KAYNAKLAR
[1] Barbosa M., Rocha J., Tramper J., Wijffels R., Acetate as a carbon source for hydrogen production by photosynthetic bacteria, 2001, Journal of Biotech. 85, 25–33,
[2] Segers, L., Verstrynge, L., Verstraete, W., Product patterns of non-axenic sucrose fermentation as a function of pH, 1981, Biotechnol. Lett. 3 (11), 635–640
[3] Shina H., Younb J., Kima S., Hydrogen production from food waste in anaerobic mesophilic and thermophilic acidogenesis, Int. J. of H2 En. 29 (2004) 1355– 1363
[4] Sasaki, K., Hydrogen and 5-aminolevulinic acid production by photosynthetic bacteria. In: Zaborsky, O.R. (Ed.), Biohydrogen. Plenum Press, 1998, pp. 133–142
[5] Segers, L., Verstraete, W., Conversion of organic acids to H2 by Rhodospirillaceae grown with glutamate as nitrogen source, 1983, Biotechnol. Bioeng. 25, 2843–2853.
[6] Koku H., Eroglu I., Gündüz U., Yücel M., Türker L., Aspects of the metabolism of hydrogen production by Rhodobacter sphaeroides, International Journal of Hydrogen Energy, Volume 27, Issues 11-12, November-December 2002, Pages 1315-1329
[7] C.Y. Lin, C.H. Lay, A nutrient formulation for fermentative hydrogen production using anaerobic sewage sludge microflora, International Journal of Hydrogen Energy, 30 (2005) 285 – 292
[8] Herbert H.P. Fang, Chenlin Li, Tong Zhang, Acidophilic biohydrogen production from rice slurry, International Journal of Hydrogen Energy (2005)
[9] I. Hussy, F.R. Hawkes, R. Dinsdale, D.L. Hawkes, Continuous fermentative hydrogen production from sucrose and sugarbeet, International Journal of Hydrogen Energy 30 (2005) 471 – 483
[10] Jıunn-Jyi Lay M, Young-Joon Lee And Tatsuya Noike , Feasibility Of Biologıcal Hydrogen Production From Organic Fraction Of Munıcipal Solid Waste, Wat. Res. Vol. 33, No. 11, Pp. 2579-2586, (1999)
[11] E. Fascetti, E. D’addario, O. Todinit And A. Robertiello, Photosynthetic Hydrogen Evolution with Volatile Organic Acids Derived from the Fermentation of Source Selected Municipal Solid Wastes, Int. J. Hydrogen Energy, Vol. 23, No. 9, pp. 753-760, 1998
[12] Herbert H.P. Fang, Hong Liu, Tong Zhang, Phototrophic hydrogen production from acetate and butyrate in waste water, International Journal of Hydrogen Energy 30 (2005) 785 – 793
[13] J.-I. Horiuchi, T. Shimizu, K. Tada, T. Kanno, M. Kobayashi, Selective production of organic acids in anaerobic acid reactor by pH control, Bioresource Technology 82 (2002) 209–213
